Вы здесь

Ферменты

ФЕРМЕНТЫ

Ферменты зубного налета явились объектом детального исследования лишь в последнее десятилетие. Наиболее фундаментальные работы по их изучению были проведены скандинавскими учеными.

Общее число ферментов, обнаруженных в зубном налете человека, превышает 50, большинство их них имеет, несомненно, микробное происхождение и лишь небольшая часть его внеклеточных ферментов поступает из слюны. Из всех групп ферментов наибольшее внимание было уделено про-теолитическим, которые в свете современных представлений играют важную роль в патогенном действии зубного налета. Первые исследования протеолитических ферментов зубного налета были проведены финским ученым Mäkinen (1966), который с помощью методов гельфильтрации выделил из него протеазы в частично очищенном виде и изучил их ферментные свойства. Как показали эти исследования, протеазы зубного налета легко расщепляют денатурированный гемоглобин, слабо действуют на нативный гемоглобин и яичный альбумин и очень слабо — на лактальбумин, сывороточный альбумин и казеин. Из синтетических субстратов с наибольшей скоростью расщепляются ß-нафтиламиды аланина, метионина и пролина, очень слабо — нафтиламиды триптофана, аспарагиновой и глутаминовой кислоты и валина. Этот фермент расщепляет также сложные эфиры α- и ß-нафтола и низших жирных кислот, причем с наибольшей скоростью расщепляется α-нафтилвалериат. Активность выделенной протеазы тормозилась параметил-сульфонилфторидом и усиливалась в присутствии ионов кобальта и марганца. ЭДТА и парахлормеркурийбензоат не оказывают никакого действия на выделенную протеазу. На основании этого автор пришел к выводу, что в зубном налете имеется сериновая протеаза с молекулярной массой 200 000, обладающая широкой субстратной специфичностью.



Почти одновременно с Mäkinen аналогичные исследования были проведены в Швеции Söder. Серия работ, опубликованных им в 1966—1967 гг., позволила выяснить многие вопросы, связанные с изучением протеолитических ферментов зубного налета человека. Установлено наличие в зубном налете протеолитической активности в отношении казеина и желатина. Детальное исследование его желатин-расщепляющей способности показало, что ионы кальция и магния активируют желатиназу, тогда как ионы меди ее тормозят. Диализ суспензии зубного налета против дистиллированной воды в течение 24 ч приводит к значительному снижению желатинолитической активности (в 4—5 раз). Прибавление кальция хлорида или магния хлорида в конечной концентрации 0,25 M не только восстанавливает активность, но даже увеличивает ее в 1.5—2 раза по сравнению с исходным уровнем. Определение оптимума pH желатинолитической активности зубного налета показало присутствие по крайней мере двух ферментов с оптимумом pH 6,5 и 8,5. Желатинорасщепляющие ферменты оказались термолабильными практически полностью теряли свою активность нагревании до 70 0C в течение 10 мин. Оптимальная концентрация ионов кальция, вызывавшая максимальное увеличение желатинолитической активности зубного налета, соответствовала 0,125 М. Такая же концентрация оказалась наиболее эффективной и для ионов магния. Ионы натрия оказывают максимальный активирующий эффект на желатинолитическую активность зубного налета в концентрации 0,5 М. Как уменьшение, так и увеличение концентрации ионов Ca и Mg приводит к резкому снижению желатинолитической активности. Лауриламин активирует желатинолитическую активность зубного налета, тогда как ЭДТА, лаурилсульфат и соевый ингибитор трипсина снижают ее. Около 70% желатинолитической активности, найденной в зубном налете, локализовалось в надосадочной жидкости.

Изучение влияния протеаз зубного налета на гемоглобин, эфиры α-1-аминокислот и поли-1-аминокислоты показало, что скорость гидролиза гемоглобина находится в прямой зависимости от концентраций суспензии зубного налета и гемоглобина. Оптимум pH для гидролиза гемоглобина составил 7,5—8,0. Гидролиз тозил-аргинин-метилового эфира был максимальным при pH 10,1. Кроме этого субстрата, протеазы зубного налета расщепляли БАЭЭ (бензоил-аргинин-этиловый эфир) и АТЭЭ (ацетил-тирозин-этиловый эфир). Наряду с этим, протеазы легко расщепляли полилизин с оптимумом pH 9—10. В то же время ферменты зубного налета, в отличие от пепсина, папаина, трипсина, фицина, поли-1-глютаминовую кислоту не расщепляли.

С помощью гельфильтрации на сефадексе G-100 и G-200 из зубного налета человека были выделены 2 протеазы, одна из которых была активна в отношении желатина, а вторя наряду с желатином легко расщепляла гемоглобин. Первая протеаза имела молекулярную массу около 200 000, оптимум pH 8,5 и активировалась ионами кальция. Вторая протеаза имела молекулярную массу 40 000—50 000, оптимум pH для расщепления гемоглобина 7,8 и также активировалась ионами кальция. Обе протеазы легко инактивировались в течение 5 мин при нагревании до 70 °С.

При дальнейшей очистке выделенных протеаз, проведенной с помощью зонального электрофореза, получены высоко-очищенные ферменты. Первый из них, с большой молекулярной массой, легко расщепляет поли-1-лизин, тогда как второй фермент на этот субстрат не действует. Обе протеазы расщепляют желатин, активируются лауриламином и в слабой степени фтористым натрием; ингибиторами этих ферментов является ЭДТА, лаурилсульфат (особенно вторая протеаза) и соевый ингибитор трипсина. Обе протеазы проявляют максимальную стабильность в пределах pH 3,5-8,5

Использование наряду с сефадексом агарозы позволило обнаружить присутствие третьей протеиназы, активной по отношению к гемоглобину и желатину. Эта протеаза имеет молекулярную массу в пределах 40 000—50 000.

В дальнейшем в образующемся зубном налете обнаружены 4 группы протеолитических ферментов, которые отделялись друг от друга с помощью гельфильтрации на сефадексе G-100. С помощью метода изоэлектрического фокусирования из зубного налета были выделены протеолитические ферменты с изоэлектрическими точками pl 4, 4,6 5,9, 6,8. Молекулярная масса этих ферментов находилась в пределах 20 000—150 000.

В зубном налете человека обнаружены ферменты, чрезвычайно легко расщепляющие а- и ß-нафтиламиды L-пpoлина и L-оксипролина (Mäkinen, 1969). Наряду с этими специфическими пептидазами также выделена неспецифическая пептидаза, легко расщепляющая нафтиламиды L-аланина, L-метионина, L-лейцина и L-фенилаланина. Эта неспецифическая пептидаза легко инактивируется парахлормеркурийбензоатом. Все изученные нафтиламидазы синтезируются лактобациллами.

Зубной налет, собранный у детей с гингивитом, имеет протеолитическую активность в 5 раз большую, чем у здоровых детей. Однако эти различия могут быть обусловлены неодинаковым количеством зубного налета у детей здоровых и больных гингивитом.

Исследование качественного состава протеолитических ферментов, выделенных из зубного налета детей и взрослых, показало отсутствие каких-либо особенностей в хроматографическом профиле этих ферментов.

Установлено, что протеолитические ферменты зубного налета имеют микробное происхождение. Энтерококки продуцируют низкомолекулярную протеазу. Ряд других микроорганизмов полости рта, включая бактероиды и дифтероиды, образуют протеолитические ферменты, которые легко высвобождаются при разрушении микробных клеток. Эти же авторы одни из первых высказали гипотезу об участии протеаз в развитии пародонтоза.

Способность стрептококков образовывать протеолитические ферменты исследована Linder и соавторами (1970).

Установлено что ферменты освобождаются в логарифмическую фазу роста  микроорганизмов с наилучшим выходом  при pH культурной среды  б—6,5. Выделенные ферменты  имели оптимум гН 7. Frösteil и соавторы (1973) изучили 110 штаммов микроорганизмов, выделенных из ротовой полости испытывая их протеолитическую активность по отношению к желатину и казеину. Оказалось, что наиболее сильной протеолитической активностью, присущей всем без исключения выделенным штаммам, обладает Str. liquefaciens. Подобная активность хотя и небольшая, присуща Corinebacteria hoffanii и ряду штаммов Str. mitis.

Исследования гиалуронидазы в зубном налете представляет особый интерес в связи с тем, что этот фермент обладает способностью расщеплять гиалуроновую кислоту — основное межклеточное вещество соединительной ткани — и тем самым увеличивать проницаемость последней. Наиболее глубокие и всесторонние исследования гиалуронидазы зубного налета были проведены группой шведских ученых. Используя вискозиметрический метод, они обнаружили гиалуронидазную активность в зубном налете человека и изучили некоторые ее свойства. Установлена значительная вариабельность в активности фермента у отдельных лиц. Фермент имел два оптимума pH 5,5 и 6,5, что свидетельствовало о присутствии более чем одной изоформы. При гель-фильтрации на сефадексе G-200 было показано присутствие двух пиков, обладающих гиалуронидазной активностью. Интересно отметить, что гиалуронидаза зубного налета весьма устойчива при температуре 4-4 0C, но очень плохо переносит замораживание. Так, через 12 дней хранения при температуре +4 0C сохранилось свыше 60% исходной гиалуронидазной активности, тогда как при температуре —20 0C — всего лишь около 11%. С помощью гельфильтрации на сефадексах и биогелях обнаружено несколько форм гиалуронидазы в зубном налете. Практически все они имели оптимум pH 6,5 ; первый пик имел добавочный оптимум при pH 5. Интересной особенностью ферментов является относительная термостабильность первого пика гиалуронидазы, тогда как второй пик отличается чрезвычайной термолабильностью.

С помощью методов солевого фракционирования, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50, гельфильтрации на биогеле, изозлектрического фокусирования и двух последовательных гельфильтраций на биогеле получен препарат гиалуронидазы, очищенный в 14 500 раз с выходом  4,4%. Гиалуронидаза зубного налета имеет микробное происхождение, так как и в макрофагах, и в костнои ткани отсутствует гиалуронидазная активность при pH 6,5, хотя имеется соответствующая активность при pH 3,5-4.



При помощи изоэлектрического фокусирования из зубного налета человека выделены две различные гиалуронидазы, которые по своим свойствам очень сходны с гиалуронидазой, выделенной из культуры зубных отложений. Оптимум pH для первого фермента равен 5—5,2, а для второго — 6,2. Оба фермента наиболее стабильны при значении pH 5—8, они быстро инактивируются при нагревании свыше 50 °С. Обнаружены 4 фракции этих ферментов с молекулярной массой 300 000, 200 000, 150 000 и 100 000.

Источником гиалуронидазы зубного налета, как указывалось выше, являются микроорганизмы, причем наиболее активными продуцентами гиалуронидазы являются Staphylococcus aureus и Streptococcus mitis, а также аэробные и анаэробные коринебактерии. Все остальные виды микроорганизмов не обладают способностью продуцировать этот фермент.

Оптимум pH гиалуронидазы находится в пределах 5,1—6,2, изоэлектрическая точка равна 8. Гиалуронидаза стабильна при значениях pH 5—9, однако фермент весьма термолабилен.

У больных гингивитом и сахарным диабетом обнаруживается очень высокая гиалуронидазная активность зубного налета.

В зубном налете человека установлено также присутствие лизоцима. Около 70% лизоцимной активности сосредоточено в осадочной фракции зубного налета. Фермент имеет оптимум pH 5,1, подобно человеческому лизоциму, весьма стабилен и в течение двух дней не изменяет своей активности при этом значении pH. Лизоцимная активность зубного налета различных субъектов варьирует в значительной степени. Источником лизоцима зубного налета, по всей вероятности, является слюна. С помощью изоэлектрического фокусирования лизоцим выделен в очищенном состоянии; он представляет собой одну единственную изо-форму, в отличие от лизоцима, находящегося в лейкоцитах. При исследовании лизоцимной активности зубного налета в динамике его образования обнаружено, что эта активность, по мере созревания зубной бляшки, проявляет тенденцию к снижению.

Кроме вышеперечисленных ферментов, в зубном налете присутствуют фосфатазы, нейраминидазы, лактатдегидрогеназы и ряд других ферментов гликолитического пути распада глюкозы.

С помощью хроматографического метода из зубного налета человека выделены несколько фракций фосфатаз, гидролизующих паранитрофенилфосфат. Ферменты имеют оптимум рН 5-6 и обладают весьма значительной устойчивостью в широком диапазоне pH. В неклеточной фракции зубного налета человека обнаружены кислая (с оптимумом pH 5,5) и щелочная (с оптимумом pH 8,5) фосфатазы Источником этих фосфатаз, по всей вероятности, являются микроорганизмы.

Ферменты зубного налета способны также вырабатывать нейраминидазу, отщепляющую сиаловые кислоты от гликопротеидов. В нем присутствует также большое число ферментов гликолитического распада углеводов, а также цикла трикарбоновых кислот и пентозо-фосфатного пути. Некоторые авторы утверждают, что, наряду с гликолитическим, действуют и другие пути распада углеводов.

Стрептококки наддесневого зубного налета вырабатывают декстранглюкозидазу (декстраназу), способную в слабокислой среде отщеплять глюкозу из декстрана.



В зубном налете человека обнаружены а-амилаза, глицеральде-гидфосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, глутаматдегидрогeназа, глутатионпероксидаза и липоамиддегидрогеназа, оксибутиратдегидрогенеза, малатдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, фосфоглюконатдегидрогеназа, пероксидаза, ДНКаза I, РНКаза и плазмин.

Нами установлено, что активность ферментов зубного налета (кислой и щелочной Фосфатаз, щелочной протеазы, катепсинов рН 3,5) изменяется в процессе его развития Как видно из рис. 3, активность кислой фосфатазы медленно и в незначительной степени снижается в первые 8 ч образования зубного налета, достоверно снижается за 12 ч в ночное время, однако к концу суток активность ее резко увеличивается.

рис. 3 Активность ферментов зубного налета, собранного в различные периоды суток

Аналогичная картина наблюдается и с щелочной фосфатазой, для которой ночное время (12 ч) характеризуется наиболее низким уровнем активности. В зубном налете, собранном за 24 ч, активность этого фермента очень высокая. Активность щелочной протеазы прогрессивно увеличивается, достигая максимальных величин к концу суток, тогда как катептическая активность, напротив, проявляет тенденцию к постепенному снижению.

Результаты определения активности ферментов в зубном налете (1—9 дней) при обычных условиях питания, указаны на рис. 4.

рис. 4 Изменение скорости образования и активности ферментов в зубном налете в процессе его созревания.

Из приведенных данных видно, что активность кислой фосфатазы, достигая больших величин в 1-е сутки, во 2-е и 3-й сутки существенно снижается, а в дальнейшем последовательно увеличивается, достигая максимальных величин на 8-й день. Активность щелочной фосфатазы на 2— 3-е сутки снижается, затем с 4-х до 8-х суток она держится на одном и том же уровне, мало отличаясь от ее значений в 1-е сутки и лишь на 9-й день резко увеличивается. Активность щелочной протеазы имеет максимальные величины в 1-й день образования зубного налета, затем постепенно снижается к 7-м суткам. В этот период активность фермента почти в 2 раза ниже исходного уровня. Активность ка-тепсинов pH 3,5 все время проявляет тенденцию к снижению, причем наиболее низкие цифры для этого фермента наблюдаются на 9-е сутки.